剖析脑功能发育，“头”等大事不忽视 | 时空简讯41期
- 来源：华大时空
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- 发表时间：2023-03-27
“头者，身之元首，人神所注。”作为人体最精密最复杂的器官，大脑拥有100多亿个神经元，是神经系统的最高级部分，控制着人体的运动、感觉、情绪、语言、执行等功能，堪称人体的“指挥官”。因此，其重要性不言而喻，关爱脑健康应作为我们关注的“头”等大事。在此，特选取了10篇与大脑发育、结构与功能相关的优质前沿文章，展示了基于时空组学和单细胞组学技术在脑科学与类脑研究中取得的代表性成果，为深入认识大脑结构与功能提供了新见解，供了解参考。
脑发育
Brain Development
人类大脑皮层类器官的发育图谱
Cell [IF：66.850]
① 对23 d到6个月等8个时间点的83个人类大脑类器官约61万个细胞进行了scRNA-seq、scATAC-seq、SHARE-seq及整合分析，绘制了人类大脑皮层类器官发育图谱（Single Cell Portal：https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell/study/SCP1756），发现类器官的细胞多样化过程与内源性密切相关，而与代谢状态无关，并识别了预计在血统建立中起作用的人类特异性基因。
② 在发育过程中，人脑类器官的细胞组成遵循与体内一致的分化转变，较低的AMI（adjusted mutual information）分数提示这一分化过程较好的重复性，细胞类型特异性表观基因组状态与转录组状态也具有一致性和可重复性。
③ 细胞多样化的过程与内源性过程密切相关，而代谢状态不影响类器官中大多数细胞的身份获取。
④ 459,711个皮层细胞的类器官发育轨迹呈现从顶端放射状胶质（apical radial glia，aRG）细胞到基质祖细胞，再分化为皮质融合投射神经元（corticofugal projection neuron，CFuPN）和胼胝体投射神经元（callosal projection neuron，CPN），或分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞前体，并进一步鉴定了分化过程中人类特异的基因和转录调控因子。
⑤ 对胼胝体细胞类型分析发现，胼胝体投射神经元的转录多样性出现在发育的早期阶段。
人类大脑皮层类器官发育图谱的试验设计示意图
scRNA-seq揭示成年猕猴海马神经前体细胞
Nature Neuroscience [IF：28.771]
① 利用优化的scRNA-seq，分析8只成年猕猴的海马齿状回（dentate gyrus，DG）脑组织，共得到207,785个细胞，鉴定出了包含所有主要海马细胞类型的34种细胞群，包括放射状胶质细胞（radial glia-like cells，RGLs）、中间祖细胞（intermediate progenitor cells，IPCs）和神经母细胞，全面揭示了一个成年猕猴神经发生过程的单细胞图谱。
② RGL与星形胶质细胞（astrocytes，Astro）很相似，都表达Astro标记物GFAP和神经祖细胞标记物SOX2、SLC1A3，免疫荧光实验证明RGL在海马DG的侧脑室下区（subventricular zone，SVZ）存在，并通过人和鼠比较验证了RGL的细胞身份；分析发现了RGL_1到RGL_2再到Astro_imm1, 2，以及最终成为成熟的Astro的分化轨迹。
③ 鉴定出新的IPC标识基因HMGB2，该基因对于神经干细胞（neural stem cells，NSC）从静止状态向增殖状态转变至关重要；IPC_1上调富集参与有丝分裂周期和DNA复制的基因，与蛋白质合成和MDM2/MDM4蛋白结合、细胞周期检查点控制以及代谢途径相关，而IPC_2则低表达神经元命运规范转录因子基因ASCL1。
④ 成神经细胞（neuroblasts，NB）是退出细胞周期后的第一步分化，RNA轨迹分析表明NB经过GC_im分化为成熟的颗粒细胞（granule cells，GC）。
⑤ 小鼠和猕猴比较分析发现，典型神经元祖细胞marker在物种间是保守的，如SLC1A3、SOX2、SOX4等；神经源性（neurogenic-related）基因分析发现，差异表达大于2倍猕猴中有43个基因，而小鼠中有12个，表明啮齿类和灵长类之间神经发生过程存在差异。
⑥ 体外培养实验得到的6,988个典型神经干细胞，经scRNA-seq分析，证实成年猕猴海马中存在具有干细胞分化能力的增殖前体细胞。
试验研究策略示意图
小鼠大脑巨噬细胞单细胞转录组图谱揭示由个体发育和组织环境形成的独特转录特性
Nature Neuroscience [IF: 21.126]
① 从稳态、患病或基因靶向小鼠中分离出全脑或单个边界区域，结合scRNA-seq、高维度细胞计数、bulk RNA-seq、命运图谱和显微镜观察，揭示了大脑内非实质巨噬细胞的多样性，并展示了边界相关巨噬细胞（border-associated macrophages, BAMs）的组织特异性特征，包括在脉络膜丛上皮顶端表面的小胶质细胞样亚群的识别。
② scRNA-seq分析显示，小鼠大脑中免疫细胞具有广泛的异质性，其中位于硬脑膜下脑膜、硬脑膜和脉络膜丛中的BAMs具有高度异质性，并表现出组织特异性的转录特征。
③ 在脉络膜丛上皮的顶端表面鉴定了一个独特的小胶质细胞亚群CPepi-BAMs，该亚群的特征基因与在神经变性条件下观察到的疾病相关的小胶质细胞类似。
④ BAMs亚群表现出混合的个体发育和高度依赖于边界区域的出生后发育，在耗竭和再生后表现出明显的自我更新能力。
⑤ 基因网络分析和条件缺失试验表明，IRF8是驱动脑巨噬细胞成熟和多样性的主调控因子。
通过scRNA-seq分析来自小鼠全脑和显微解剖边界区域的CD45+免疫细胞
人类前脑少突胶质细胞发生过程
Developmental Cell [IF: 13.417]
① 应用scRNA-seq和scATAC-seq，并通过空间原位测序（ISS）和RNAscope对受孕后（post-conception weeks，PCW）8、8.5、9和10周4个时间点的人类胚胎前脑进行分析，揭示了少突胶质细胞发生的第一波进化保守机制，并描述了少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）特征的相关调节机制。
② 基于液滴的scRNA-seq分析人类胎儿前脑组织，构建了25,161个单细胞转录组图谱，主成分分析得到32个细胞群，在PCW8的前脑中出现了第一波少突胶质细胞谱系细胞，如OPCs、pre-OPCs等。
③ 构建了一种新的谱系推断框架来预测人类少突胶质细胞的谱系状态，如：内侧神经节隆起（medial ganglionic eminence，MGE）区域因子NKX2-1和GSX1/2的表达标志着OPC分化轨迹的起始，EGFR、ZFP36L1和HES6的表达密切相关，OPC分化轨迹中涉及多种组细胞和多个中间状态。
④ scRNA-seq和scATAC-seq谱系分析，深入探究pre-OPCs到OPCs的过渡过程，确定了OPC分化过程中的的关键基因（DLX5、DLX2、DLX1等）和关键调控因子（OLIG2、SOX10、SOX8、NKX2-2、SOX6等）。
⑤ ISS确定了少突胶质细胞最先发生于人类胎儿前脑的腹侧位点。
主要发现示意图
小鼠缰核发育过程的分子特征和细胞多样性
Cell Reports [IF：9.995]
① 选取E11、E12、E13、E15、E18、P4、P7和成年阶段的雌雄小鼠大脑组织样本，进行scRNA-seq分析，结合解剖学和功能分析等方法，构建了发育关键阶段的小鼠缰核（habenula，Hb）神经元表达谱，揭示了在胚胎和出生后发育期间小鼠Hb神经元不同亚型的发育轨迹，为进一步研究正常和疾病状态下的Hb发育确立了研究框架。
② 基于FACS的CEL-seq2、scRNA-seq分析，获得了小鼠Hb的8个不同年龄阶段的5,756个转录组，表达38,068个基因，聚类分为了14种不同的细胞簇，揭示了发育中小鼠Hb的细胞异质性，并确定了异质性主要是在出生后发育阶段产生的。
③ 通过轨迹推断分析，揭示了在胚胎和出生后发育过程中导致不同Hb亚型的细胞和分子轨迹，并鉴定了相应的基因调控网络。
④ 研究候选基因家族的发育基因表达模式，发现Cartpt+Hb神经元主要分布在Hb边缘，Cartpt基因标记了支配背侧脚间核（interpeduncular nucleus，IPN）的生理上不同的神经元，确定了Cartpt+Hb神经元亚型的独特功能特性和投射目标。
⑤ 单细胞转录谱和GWAS数据的比较，发现了与人类精神疾病的风险基因座一致的Hb细胞类型，从而将特定的发育Hb亚型与精神疾病联系起来。
研究设计与主要发现
脑结构与功能
Brain Structure and Function
成人脑单细胞转录组和表观状态整合分析
Nature Biotechnology [IF：35.724]
① 对成人额叶皮层（BA6、BA9、BA10）、视皮层或视觉区域（BA17、V1）和小脑外侧半球取样（n=36,166）进行snDrop-seq分析，共鉴定出35个细胞类群。
② 同时对以上样本进行了单细胞转座子超敏感位点测序（scTHS-seq）分析（n=32,869），共鉴定到287,381个和染色质可及性位点相关的峰（peaks），基于差异可及性位点相邻的基因的功能注释，鉴定出Ex、In、Gran、Ast、Oli、OPCs、Mic和End八种细胞类型。
③ 鉴定出皮层中不同细胞类型和亚类以及不同脑皮层（layer）的标识基因及不同ExN、InN亚群在layer的空间特异性定位，确定了不同细胞类型在小脑不同结构中的特异性，提供了细胞类型鉴定标识基因及这些细胞类型在空间上的分布特征。
④ 训练出新的梯度提升模型（gradient-boosting model，GBM），可以将转录组数据和染色质可及性数据整合进行细胞类型鉴定，提供更精确的细胞分群，并且发现细胞类型的标识基因的可及性位点集中在启动子附近；阐明了成年脑中少突胶质细胞祖细胞向少突胶质细胞转化过程中的关键转录因子及其结合位点和可及性的改变。
⑤ 利用全基因组关联分析（GWAS），将人类疾病相关位点与细胞类型关联起来，发现Mic与阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）风险变异高度显著富集，这与晚发性AD皮质中被激活的显著Mic信号一致。
研究策略示意图
小鼠大脑及其边缘组织免疫细胞的scRNA-seq和蛋白质谱分析
Nature Protocols [IF：17.021]
① 提供了一个详细的有关综合高清流式细胞术、scRNA-seq和CITE-seq表征小鼠大脑在稳态、炎症和疾病下免疫区室的协议和实验工作流程，且除了湿实验室程序的分步概述外，还提供了有关数据分析和实验设计的建议。
② 首先，对如何显微解剖小鼠大脑边界区域进行分步描述，以及针对这些组织中的每一个组织量身定制的解离协议；然后，概述了通过Genomics平台进行高清流式细胞术和scRNA-seq所涉及的步骤，并详细介绍了如何使用实施CITE-seq以获得与转录组分析相结合的无偏蛋白质表达筛选；最后，描述了单细胞测序数据的处理、分析和聚类识别的主要步骤。
③ 给出了开展相关研究所需的资源配置，指出湿实验室工作流程可以由经过适当培训的研究人员（具有细胞和分子生物学的基本能力）完成，并且需要6 ~11 h，具体取决于所选择的程序；计算分析需要具有生物信息学和R编程背景。
④提供了大脑免疫图谱交互网站www.brainimmuneatlas.org，包含Movahedi实验室生成的scRNA-seq数据集，这些数据集捕获了健康和疾病中的人类和小鼠大脑免疫细胞。
小鼠大脑及其边缘组织免疫细胞的单细胞RNA和蛋白质谱分析流程
成年小鼠大脑的分子图谱
Science Advances [IF: 13.116]
① 利用空间转录组技术，完全基于组织基因表达分类生成详细的解剖学定义，建立了一个成年小鼠大脑的分子图谱，以用于定义大脑区域的空间组织，包括用于定位和靶向离散的神经解剖域的分子代码。
② 通过捕获成年小鼠大脑的空间基因表达特征，可仅根据分子信息生成详细的全脑图谱，推断出大脑复杂而详细的神经解剖组织，建立神经解剖学中空间定义的正式系统。
③ 利用分子图谱绘制单个细胞的空间起源，证明了分子图谱作为利用单细胞分子信息绘制神经元空间起源的资源的价值。
④ 该分子图谱进一步支持了神经元的单细胞RNA图谱的空间特性，并提供了一个使用最小的基因集——大脑调色板（brain palette）来注释大脑的资源。
成年小鼠全脑分子图谱
不同实验方案生成的大脑类器官和人胎脑单细胞转录组的综合分析
Cell Reports [IF：9.423]
① 对比了8个采用不同实验方案培养的大脑类器官scRNA-seq公共数据集和GSW8-26人胎脑的前额叶皮层scRNA-seq数据，共获得190,022个细胞，鉴定出13种细胞类型。
② 不同实验方案产生的类器官具有相似的细胞构成，而非诱导方案产生的类器官具有更多样化的细胞组成。此外，发现脑类器官中存在独特的细胞类型，其高表达蛋白聚糖表达基因（proteoglycan PGC）和内皮基因。
③ 重构大脑类器官的发育轨迹，鉴定了3条发育旁路（B1、B2、B3），不同方案的神经上皮细胞（neuroepithelial cells，NECs）都通过B1旁路分化，因此B1是主要的神经元分化轨迹，次要代替途径B2由有丝分裂期的NECs构成，B3主要是由CBCs和BRCs构成，不同方案产生的大脑类器官具有不同的发育路径偏好性，例如，Fiddes et al和Velasco et al方案对B2旁路有最高偏好性，Xiang et al和Quadrato et al方案对B3旁路有最高偏好性。
④ 比较不同实验方案的大脑类器官与胎脑发育相应阶段的scRNA-seq数据，发现所有大脑类器官均显示，与黏着斑或内质网相关的基因（调节树突棘中的蛋白质运输）显著上调；有氧呼吸基因表达显著下调和凋亡基因表达显著上调，可能是由于类器官缺乏血管结构，氧气和营养物质有限地交换到类器官最内部的结果。
⑤ 使用融合类器官模型（fusion organoid models）证明抑制性神经元来自MGE/sub-pallium并迁移到皮层区域。
研究策略设计流程
小鼠脑室下区成年神经干细胞的可变剪切特征
Frontiers in Cell and Developmental Biology [IF：6.684]
① 选取成年小鼠脑室下区（subventricular zone，SVZ）的28份样本，利用荧光激活细胞分选区分CD133阳性和阴性室管膜/室管膜下细胞进行scRNA-seq，利用SpliceSeq方法确定了来自1,908个基因的7种一共3,611个可变剪切（alternative splicing，AS）事件，系统地描述了AS在静止神经干细胞（quiescent neural stem cell，qNPC）、激活神经干细胞（activated neural stem cell，aNPC）、成神经细胞（neuroblast cell，NEUb）、少突胶质细胞和其他细胞中的特征。
② 对28份来自同一小鼠的单细细胞数据（n=3,611）和4个群体（pooled）来源的单细胞细胞数据（n=3,379）进行差异表达可变剪切分析，发现基于单细胞水平可以检测到低丰度剪切异构体，而基于群体的水平无法找到。
③ 采用AS分析8个CD133+ qNPC、2个aNPC和11个NEUb样本的scRNA-seq数据，发现只有少数AS事件具有细胞类型特异性，大多数AS事件具有高度异质性。
④ 从qNPC、aNPC、NEUb和少突胶质细胞中随机各抽取一个样本，利用编码潜力计算机（coding potential calculator，CPC）方法进行可变剪接异构体的编码潜力分析，发现一个基因可以同时在单个细胞中表达多种异构体，并经双细胞期小鼠发育胚胎的scRNA-seq数据验证了该结论。
⑤ 分析qNPC中的scRNA-seq数据，发现了双顺反子转录本（bicistronic transcripts）的存在，并经RT-PCR、克隆和Sanger测序得到证实。
scRNA-seq检测的七种可变剪切类型
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